| 导读 |

近日，两个卵子结合产生后代的研究一经发表，立即引起热议，很多男性开始担心自己的“生殖地位”会下降。事实上，男性的半边天在一连串打击下饱受压力：Y 染色体的消失、克隆动物的出现以及两个卵子可产生后代。雄性动物会被“忽略”吗？

没有“爸爸”的小雌鼠。供图：李劲松

两个卵子的结合，居然成功产出健康的幼鼠，整个过程无需雄性参与。这一颠覆了人们对生殖认识的研究成果，2015 年 11 月 17 日发表在科学期刊 Cell Rsearch 上，引发媒体持续地关注。

这项研究是上海生化与细胞研究所研究员李劲松在单倍体细胞系研究领域的又一次突破。很多人担心这一技术会使用在人类身上。对此，李劲松表示，“强烈反对利用这种技术来制造人类后代”。

中国科学院上海生化与细胞研究所研究员李劲松

- 令人着迷的单倍体细胞系 -

单倍体细胞系研究一直让各国科学家着迷。这是因为通过单倍体细胞克隆的个体是研究者研究生命奥秘的理想模型，研究者可针对单倍体细胞进行基因编辑。由此产生的表型直接体现在幼鼠身上，极大地提高了基因编辑的效率。

李劲松对这一领域的兴趣并非一时兴起，当年还在洛克菲勒大学做博后的他，面临着抉择：回国后是继续他博后进行的嗅觉神经方面研究，还是从事他从本科到博士一直进行的干细胞研究。经历一番挣扎后，李劲松继续他所热爱的胚胎发育与细胞重编程研究。

对于很多低等生物来说，如酵母、蕨类植物等，它们可以以单倍体的形式存活。但对于高等生物来说，单倍体只存在其成熟后形成的配子中，如精子和卵子。从严格意义上来讲，卵子也是双倍体，因为它只有在受精之后，才会将第二极体排出形成单倍体。单倍体细胞只有一套染色体，降低了基因组的复杂程度，在遗传分析、基因功能与性状研究中具有重要的应用价值，因而单倍体细胞是生命科学研究的窗口以及重要工具。然而如何获得高等动物的单倍体细胞系研究，一直困扰着这一领域的各国科学家。

2012 年，李劲松和徐国良合作通过将精子注入去核的卵母细胞中建立小鼠的类精子单倍体细胞系，成功与小鼠的卵细胞结合，产生具有稳定遗传性状的幼鼠。这项具有突破性的研究发表在 Cell 杂志上。

“2012 年发表这项研究时，Cell 杂志的编辑也认为，建立一个可培养的类精子单倍体细胞系，从概念到技术都很新颖。”李劲松表示。

事实上，无论是人类还是小鼠，从精原干细胞到最后在附睾加工成成熟的精子这一过程非常复杂，精子一旦成熟，结构功能特化，而且不会再分化，如果在体外能建立一个类精子单倍体细胞系，并且能代替精子与卵子结合形成受精卵，意义会很大。

同年，中科院动物研究所研究员周琪、赵小阳也利用小鼠的精子与去核的卵细胞结合形成孤雄单倍体细胞，再与卵细胞进行结合，产生出健康的小鼠。该研究发表在 Nature 杂志上。

尽管半克隆小鼠的研究结果令人振奋，但是如何将这项技术从概念向工具转化仍有阻力。研究者发现半克隆小鼠出生效率很低，仅为 4.5%，且将近一半的幼鼠出现发育不良的现象。

2013 年一整年，李劲松实验室一直在寻找解决这个问题的关键。最终他们发现，雄性印记基因 H19 在半克隆小鼠中高表达，是导致小鼠出生率低、发育迟缓的关键因素。当研究者修复基因 H19 的表达后，发现半克隆小鼠的出生率显著提高，但是发育失败率仍然很高。后来发现另一雄性印记基因 Gtl2 同样过表达，于是研究者再将这个基因的表达进行修复，结果小鼠的出生率达到了 20%。这一结果显示，两个雄性印记基因的过表达，导致小鼠发育率低以及发育异常。

至于半克隆小鼠为何全都是雌鼠，李劲松表示，精子分为两种，或携带 X 染色体，或携带 Y 染色体，它们进入卵子后分别产生雌性和雄性个体。但是，所有的单倍体干细胞，不管是精子来源，还是卵子来源，全部都是携带 X 染色体的，所以利用单倍体干细胞产生的半克隆小鼠均是雌性。

李劲松进一步解释，X 染色体上有上千个基因，对细胞的生存有着至关重要的作用，细胞如果没有 X 染色体是不能存活的，因此不可能从 Y 染色体的精子中产生单倍体细胞系，后代自然不会出现半克隆的雄性个体。目前的研究发现，这些半克隆小鼠能够健康长大成年并具有生育能力，至于这些小鼠未来是否存在其它方面的健康隐患，目前还不得而知。

- 当半克隆技术遇到 CRISPR/Cas9 -

2013 年，李劲松课题组的一篇文章显示，通过直接向携带白内障遗传缺陷的小鼠受精卵中注入 CRISPR/Cas9 系统后，即可编辑受精卵的基因达到修复遗传缺陷的目的。但是，当时的修复效率只有 30%，且经过基因编辑的受精卵存在少量的脱靶。

为了解决这两个问题，2014 年，李劲松课题组与北京大学汤富酬实验室和上海生化与细胞研究所吴立刚实验室合作，利用 CRISPR/Cas9 在白内障小鼠精原干细胞中进行遗传修复并建立一系列的精原干细胞系，通过严格分析，选择修复的并且不携带任何脱靶的精原干细胞进行体内移植，用于产生健康的雄性配子，从而实现后代 100%不携带白内障遗传缺陷。随着半克隆技术和 CRISPR/Cas9 基因编辑技术的日趋成熟，通过两种技术的结合进行小鼠疾病模型建立或者遗传疾病的治疗研究变得更简单。

李劲松认为，利用 CRISPR/Cas9 系统改造生殖细胞主要有两个策略，一是编辑受精卵，二是编辑生殖单倍体细胞（配子），编辑生殖单倍体细胞更具前景，因为它能在配子结合成受精卵之前进行筛查，从而保障配子的基因改造准确性大大提高，减少 CRISPR/Cas9 技术由于脱靶带来的弊端。正由于 CRISPR/Cas9 技术目前还存在脱靶问题，因此他反对目前将该技术使用在人类生殖细胞基因修饰上。“这会存在很大的风险”，李劲松表示。

- 雄性会逐渐被“忽略”吗? -

两个卵子结合产生后代的研究一经发表，立即引起人们的热议，很多男性开始担心自己的地位会下降。事实上，男性的半边天在一连串打击下饱受压力：Y 染色体的消失、克隆动物的出现以及两个卵子可产生后代。雄性动物真的会被“忽略”吗？

1600 万年前，X、Y 染色体同时出现，拥有相同的长度，但随后 Y 染色体不断缩短，截至目前其仅为 X 染色体长度的 1/3。澳大利亚拉筹伯大学（La Trobe University）研究员詹妮弗·格拉芙（Jennifer Graves）甚至给出 Y 染色体 450 万年后很有可能会消失的论断，雄性动物的地位似乎岌岌可危。

自然法则似乎也印证了格拉芙这一令人不安的结论：一种生活在日本的田鼠，在进化过程中竟将自己的 Y 染色体弄丢，好在它们在细胞的常染色体上重新找到新的性别决定基因，如果不是这样，那么它们只会落入进化终结的死胡同里，继而灭绝，从这个星球上消失。它们的现在或许是人类的未来吗？

正如我们所知，很多动物的繁殖需要精卵结合才可孕育下一代，但对于低等生物个体而言，它们采取无性生殖，即可大量繁衍后代，从而迅速建立种群优势。稍微高等的一些动物，它们会采取无性和有性生殖结合的繁殖策略，当食物丰盛、气候适宜时，它们会把精力放在快速增殖上，采取无性生殖策略，当天气开始变冷，环境恶劣时，雌性个体通常会寻觅雄性个体进行有性生殖，从而产生健壮的后代以度过艰难时刻。脊椎动物营有性生殖，繁殖下一代需两性结合。

自从克隆动物出现后，这一规则受到严峻挑战。1996 年，英国爱丁堡大学科学家伊恩·维尔穆特（Ian Wilmut）利用细胞核移植技术，在全球首次克隆出大型哺乳动物——克隆羊“多莉”，“多莉”没有父亲，它是维尔穆特利用一只羊的乳腺细胞的细胞核与另外一只羊的去核卵细胞结合诞生的，它是人类第一次真正意义上利用“无性生殖”的方式产生出的哺乳动物，随后猫、狗、猪、牛等动物相继被克隆出来。

颠覆人们对生殖的认识的科学研究似乎没有停止的意思。李劲松研究组这项发表在 Cell Research 杂志上的研究显示：两个卵子也能产生出健康的后代。研究人员通过在卵子中建立携带基因修饰的单倍体细胞系，然后再将这些细胞与另一只雌鼠的卵细胞结合，之后可高效地产生出健康的小鼠出来。

至于两个精子是否产生后代，李劲松在接受媒体采访时如是回答，“精子比卵子小得多、简单得多。卵子有可能被改变成精子，但反过来就会困难得多。”

- 单倍体细胞系的未来应用 -

事实上，科学家持续开展的单倍体细胞系的研究对生命科学的基础研究、人类疾病研究的意义远大于人们对于雄性个体地位可能被“忽略”的担忧。

2015 年上半年，李劲松实验组成功建立了“类精子细胞”的单倍体细胞系，它们能稳定地与雌鼠的卵细胞结合，产生出半克隆小鼠。由于小鼠研究在人类健康以及癌症等方面具有很大的参考价值，这些具有稳定遗传的“类精子细胞”的单倍体细胞系自然意义非凡。

单倍体细胞系的建立，未来有望作为一个工具来使用，研究者可进行多基因的敲除或者敲入实验。例如，研究者对三个基因的同时表达感兴趣，可以通过把这些基因敲入单倍体干细胞中，然后通过卵子注射获得携带三基因同时敲入的半克隆小鼠。

事实上，人类的疾病大多数也是由多基因突变或缺失引起，如果将这些突变基因敲入到单倍体细胞体系中，那么人们就能很好地建立人类疾病的小鼠模型，通过对小鼠的表型研究，有助于人们了解这类疾病的发生以及发展。以往科学家都是基于细胞水平研究人类多基因介导的疾病，很难做到个体水平的研究，现在已经可以通过哺乳动物的个体模型来研究人类的疾病特征。

在采访结束时，李劲松表示，下一步的主要工作是在灵长类动物身上建立能代替精子使用的单倍体细胞系，从而可以通过注入卵子获得半克隆猴子，进而更好地研究人类的疾病。

致谢：感谢李劲松老师对本文的修正。

李劲松简介

中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所研究员，主要进行细胞重编程与胚胎发育方面的研究。

2002 年获中科院动物研究所博士学位，在美国洛克菲勒大学进行 5 年博士后研究，2007 年回国，至今任中科院上海生科院生化与细胞所研究员、上海科技大学生命科学学院特聘教授，并先后获得何梁何利基金奖、谈家桢生命科学奖等奖项。

相关文章：

1. Zhong C， Xie Z， Yin Q， Dong R， Yang S， Wu Y, Yang L & Li J. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection. Cell Research. 2015.

2. Zhong C, Yin Q, Xie Z, Bai M, Dong R, Tang W, Xing Y, Zhang H, Yang S, Chen L-L, Bartolomei MS, Ferguson-Smith A, Li D, Yang L, Wu Y & Li J. CRISPR-Cas9-mediated genetic screening in mice with haploid embryonic stem cells carrying a guide RNA library. Cell Stem Cell. 2015.

3. Wu Y, Zhou H, Fan X, Zhang Y, Zhang M, Wang Y, Xie Z, Bai M, Yin Q, Liang D, Tang W, Liao J, Zhou C, Liu W, Zhu P, Guo H, Pan H, Wu C, Shi H, Wu L, Tang F & Li J. Correction of a genetic disease by CRISPR-Cas9-mediated gene editing in mouse spermatogonial stem cells. Cell Research. 2015.

4. Wu Y, Liang D, Wang Y, Bai M, Tang W, Bao S, Yan Z, Li D & Li Jinsong. Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell Stem Cell. 2013.
5. Yang H, Liu Z, Ma Y, Zhong C, Yin Q, Zhou C, Shi L, Cai Y, Zhao H, Wang H, Tang F, Wang Y, Zhang C, Liu X, Lai D, Jin Y, Sun Q & Li J. Generation of haploid embryonic stem cells from Macaca fascicularis monkey parthenotes. Cell Research. 2013.

6. Yang H, Shi L, Wang B, Liang D, Zhong C, Liu W, Nie Y, Liu J, Zhao J, Gao X, Li D, Xu G-L & Li Ji. Generation of genetically modified mice by oocyte injection of androgenetic haploid embryonic stem cells. Cell. 2012.

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